BIOINFORMATICA

ESERCITAZIONE 3 (tratta da didattica.cribi.unipd.it)

OBIETTIVO

L'esercitazione prevede l'utilizzo di risorse web per effettuare ricerche di similarità con la proteina GRB2 (growth factor receptor-bound protein 2, Homo sapiens) e con il messaggero che la codifica. Tale proteina è coinvolta nei processi di trasduzione del segnale.

La ricerca dovrà essere effettuata a partire dai seguenti link:


 

RECUPERO DELLA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DI GRB2


 

RICERCA DI SIMILARITA’ CON LA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DI GRB2 UTILIZZANDO IL PROGRAMMA BLASTN


 

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DI BLASTN

La pagina dei risultati si può dividere in cinque parti (dall’alto in basso):

PRIMA PARTE
La prima parte dà informazioni sul programma (in questo caso BLASTN), sulla sequenza "query" (quella con cui si effettua la ricerca), tra le quali la sua lunghezza (indicata come "nn letters", dove "letters" sta per basi), e sul database utilizzati. Presenta inoltre un link denominato "Taxonomy reports", da cui si arriva ad una pagina che presenta tre diverse organizzazioni dei risultati di una data ricerca effettuata con BLAST, in base all'informazione presente nel database tassonomico dell'NCBI.

SECONDA PARTE
La seconda parte consiste in una immagine che illustra graficamente i risultati (Figura 1):

rappresentazione grafica

Figura 1

TERZA PARTE
La terza parte consiste nell'elenco delle sequenze nucleotidiche del database scelto che producono allineamenti significativi con la sequenza "query" e comincia con la frase: "Sequences producing significant alignments:". Le sequenze sono ordinate in base all'E value (colonna a destra), parametro che misura la significatività degli allineamenti: minore è, più significativo è l'allineamento. Ciascuna sequenza contiene un link (parte sottolineata e in colore), da cui si arriva al record di Entrez relativo a quella sequenza. A destra, per una data sequenza sono inoltre eventualmente presenti i link a LocusLink ("L") e UniGene ("U").

QUARTA PARTE
La quarta parte visualizza gli allineamenti significativi della sequenza "query" con sequenze del database scelto (vedi Figura 2) e comincia con la frase: "Alignments".

allineamento

Figura 2

Data una sequenza del database scelto che produce uno o più allineamenti significativi con la sequenza "query", come prima cosa viene visualizzata la descrizione della sequenza del database, che contiene un link (parte sottolineata e in colore), da cui si arriva al record di Entrez relativo a quella sequenza. La descrizione contiene eventualmente anche i link a LocusLink ("L") e UniGene ("U"). Sotto la descrizione è indicata la lunghezza in basi della sequenza.
Successivamente vengono visualizzati il o gli allineamenti di questa sequenza con la sequenza "query".
Per ciascun allineamento è indicato:

Vale la relazione: lunghezza allineamento = identities + gaps + altri mismatch nell'allineamento (ad esempio "a" che sia allinea con "t", ...).
Successivamente si ha l'allineamento vero e proprio tra la sequenza "query" e la sequenza del database in questione, denominata "Sbjct".
I numeri indicano la posizione delle basi all'interno delle rispettive sequenze: ad esempio, il numero 160 cerchiato in rosso nella Figura 2 sta ad indicare che la base "t", indicata con la freccia rossa, è la base numero 160 nella sequenza del database.
Se in una data posizione dell'allineamento la base nella sequenza "query" e la corrispondente della sequenza del database coincidono, nella riga tra le due sequenze compare il carattere "|".
Quando tale carattere non è presente significa che, in quella posizione dell'allineamento, la base nella sequenza "query" e la corrispondente della sequenza del database sono diverse oppure che una delle due sequenze presenta un gap.

QUINTA PARTE
La quinta parte contiene dettagli statistici della ricerca.
 
 
 

RECUPERO DELLA SEQUENZA AMINOACIDICA DI GRB2


 

RICERCA DI SIMILARITA’ CON LA SEQUENZA AMINOACIDICA DI GRB2 UTILIZZANDO IL PROGRAMMA BLASTP


 

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI DI BLASTP

La pagina dei risultati si può dividere in cinque parti (dall’alto in basso), del tutto equivalenti a quelle dei risultati di BLASTN visti precedentemente:

PRIMA PARTE
La prima parte dà informazioni sul programma (in questo caso BLASTP), sulla sequenza "query" (quella con cui si effettua la ricerca), tra le quali la sua lunghezza (indicata come "nn letters", dove "letters" sta per aminoacidi), e sul database utilizzati. Presenta inoltre un link denominato "Taxonomy reports", da cui si arriva ad una pagina che presenta tre diverse organizzazioni dei risultati di una data ricerca effettuata con BLAST, in base all'informazione presente nel database tassonomico dell'NCBI.

SECONDA PARTE
La seconda parte consiste in una immagine che illustra graficamente i risultati (equivalente alla Figura 1):

TERZA PARTE
La terza parte consiste nell'elenco delle proteine del database scelto che producono allineamenti significativi con la sequenza "query" e comincia con la frase: "Sequences producing significant alignments:". Le sequenze sono ordinate in base all'E value (colonna a destra). Ciascuna sequenza contiene un link (parte sottolineata e in colore), da cui si arriva al record di Entrez relativo a quella sequenza. A destra, per una data sequenza sono inoltre eventualmente presenti i link a LocusLink ("L").

QUARTA PARTE
La quarta parte visualizza gli allineamenti significativi della sequenza "query" con sequenze del database scelto (vedi Figura 3) e comincia con la frase: "Alignments".

allineamento2

Figura 3

Data una sequenza del database scelto che produce uno o più allineamenti significativi con la sequenza "query", come prima cosa viene visualizzata la descrizione della sequenza del database, che contiene un link (parte sottolineata e in colore), da cui si arriva al record di Entrez relativo a quella sequenza. La descrizione contiene eventualmente anche il link a LocusLink ("L"). Sotto la descrizione è indicata la lunghezza in aminoacidi della sequenza.
NOTA: possono essere presenti più sequenze del database contemporaneamente (come nel caso della Figura 3), se il database è non ridondante (come il database scelto per la ricerca con BLASTP): la ragione per cui sono associate è perché coincidono esattamente dal primo all'ultimo aminoacido; per una spiegazione più dettagliata del perché questo si verifichi si rimanda all'esercitazione.
Successivamente vengono visualizzati il o gli allineamenti di questa sequenza con la sequenza "query".
Per ciascun allineamento è indicato:

Vale la relazione: lunghezza allineamento = identities + gaps + altri mismatch nell'allineamento.
Successivamente si ha l'allineamento vero e proprio tra la sequenza "query" e la sequenza del database in questione, denominata "Sbjct".
I numeri indicano la posizione degli aminoacidi all'interno delle rispettive sequenze: ad esempio, il numero 120 cerchiato in rosso nella Figura 3 sta ad indicare che l'aminoacido "E" (acido glutammico), indicato con la freccia rossa, è l'aminoacido numero 120 nella sequenza del database.
Se in una data posizione dell'allineamento l'aminoacido nella sequenza "query" e il corrispondente della sequenza del database coincidono, la lettera che lo rappresenta viene ripetuta nella riga tra le due sequenze (vedi, ad esempio, la posizione indicata dalla freccia blu in Figura 3).
Il carattere "+" indica che, in una data posizione dell'allineamento, l'aminoacido nella sequenza "query" e il corrispondente della sequenza del database sono simili.
Quando nella riga tra le due sequenze carattere non è presente nessun carattere significa che, in quella posizione dell'allineamento, l'aminoacido nella sequenza "query" e il corrispondente della sequenza del database sono diversi oppure che una delle due sequenze presenta un gap.

QUINTA PARTE
La quinta parte contiene dettagli statistici della ricerca.
 
 

ALLINEAMENTO TRA LA SEQUENZA AMINOACIDICA DI GRB2 E SRK1_SPOLA

Figura 4

ALLINEAMENTO TRA LA SEQUENZA AMINOACIDICA DI GRB2 E SRK1_SPOLA CON DOTLET

Collegarsi al sito del DOTLET e seguire l'help sull'uso della risorsa cliccando sul need help? . Lo scopo è di analizzare ulteriormente eventuali zone ripetute o pattern nell'allineamento tra le due sequenze GRB2 e SRK1_SPOLA. Attenzione a copiare nella finestra di INPUT (che appare dopo aver cliccato il tasto corrispondente "input") solo la sequenza Amminoacidica senza l'intestazione con il '>', dare il nome corrispondente e cliccare OK (GRB2 per la prima sequenza e SRK1_SPOLA per la seconda sequenza). Dopo aver caricato le due sequenze selezionare dal menu a destra del tasto "input" la sequenza GRB2 e nel secondo menu a fianco la sequenza SRK1_SPOLA. A questo punto si può cliccare sul tasto "compute". Ad ogni pixel della matrice di allineamento che comparirà corrisponde un amminoacido della sequenza in ascissa ed il corrispondente amminoacido della sequenza in ordinata. L'istogramma che appare a fianco della matrice di allineamento rappresenta, invece, il range di punteggi tra le varie zone di allineamento della matrice. E' possibile filtrare le regioni di appaiamento tra le due sequenze che non hanno similarità significativa nel loro intorno. Selezionando un range compreso tra il 35% e il 40% si potranno mettere in evidenza due zone principali di allineamento tra le due sequenze e corrispondenti, all'incirca, a quelle trovate in precedenza con il BLAST. Variando il range nella finestra dell'istogramma, si potranno mettere in evidenza ulteriori deboli regioni di similarità tra le due sequenze.
 
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